細胞轉染操作方法全過程

　　轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

　　理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

　　需要指出的一點，無論采用哪種轉染技術，要獲得最優(yōu)的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。

　　一、細胞傳代

　　1.試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。

　　2.棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

　　3.用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。

　　4.加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。

　　5.用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。

　　6.將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

　　7.用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

　　8.將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

　　9.將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。

　　二、細胞轉染

　　1.轉染試劑的準備

　　①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

　　②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

　　2.選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

　　3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。

　　4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

　　5.加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

　　6.到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。

　　三、第二次細胞傳代

　　1.在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

　　2.再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉入培養(yǎng)皿中。

　　3.在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。