細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法

　　細(xì)胞凍存方法

　　1.細(xì)胞：選對數(shù)生長期細(xì)胞，收集細(xì)胞24小時前換液一次。

　　2.計數(shù)：按常規(guī)方法把細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計數(shù)，令細(xì)胞密度達(dá)5×106/ml，離心去上清，吸入離心管中。

　　3.凍存液：先用培養(yǎng)液9分+DMSO1分(或甘油)配成10%的DMSO凍存液，按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。

　　4.分裝：分裝入無菌安剖中，每安剖加1.5毫升細(xì)胞懸液。

　　5.封口：用塑料安剖時擰緊瓶口即可;如用火焰封閉安剖口后，仔細(xì)檢查，定要封嚴(yán)，必要時可浸入藍(lán)色液中觀察，為安全起見，把安剖縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人;紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細(xì)胞名稱，凍存日期，以便日后查找。

　　細(xì)胞復(fù)蘇方法

　　1.從液氮罐中取出安剖;有時因安剖未封嚴(yán)，浸入了液氮，取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。

　　2.迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍。

　　3.剪開紗布口袋，取出安剖，用70%酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。

　　4.低速離心(500～1000轉(zhuǎn)/分)5分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。

　　5.加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。